Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
За Международную Единицу принимают активность фактора II в установленном количестве Международного Стандарта, состоящего из высушенного из замороженного состояния концентрата человеческого фактора свертывания крови II. Эквивалентность Международного Стандарта в Международных Единицах устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.
Хромогенный метод количественного определения включает две последовательные стадии: индуцируемая змеиным ядом активация фактора II и ферментативное расщепление хромогенного субстрата фактором На с образованием хромофора, который определяют спектрофотометрически. В соответствующих условиях испытания существует линейная зависимость между активностью фактора На и расщеплением хромогенного субстрата.
РЕАГЕНТЫ
Специфический активатор фактора II из яда эфы (Экарин). Белок, получаемый из яда эфы (Echis carinatus), специфически активирующий фактор II. Восстанавливают в соответствии с инструкциями производителя. Восстановленный препарат хранят при 40С и используют в течение 1 месяца.
Хромогенный субстрат фактора IIa. Специфический хромогенный субстрат для фактора IIa, например: Н-й-фенилаланил-Ь-пипеколил-Ь-аргинина 4-
нитроанилида дигидрохлорид, 4-толуолсульфонил-глицил-пролил-Ь-аргинина 4-
нитроанилид, Н^-циклогексилглицил-а-аминобутирил^-аргинина 4-нитроанилид, D-циклогексилглицил-L-аланил-L-аргинина 4-нитроанилида диацетат.
Восстанавливают в соответствии с инструкциями изготовителя.
Буфер для разведений. Раствор, содержащий 6,06 г/л трис-(гидроксиметил)-аминометана R, 17,53 г/л натрия хлорида R, 2,79 г/л (этилендинитрило)-тетрауксусной кислоты R и 1 г/л бычьего альбумина R или человеческого альбумина R. При необходимости доводят значение рН до 8,4 с использованием хлористоводородной кислоты R.
МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Испытуемый раствор. Испытуемый препарат разбавляют буфером для разведений, получая раствор с содержанием 0,015 МЕ фактора II в миллилитре. Готовят не менее трех дальнейших разведений с использованием того же буфера.
Раствор сравнения. Препарат сравнения разбавляют буфером для разведений, получая раствор с содержанием 0,015 МЕ фактора II в миллилитре. Готовят не менее трех дальнейших разведений с использованием того же буфера.
Все растворы перед испытанием нагревают на водяной бане до 370С.
Нижеописанные условия определения относятся к титрационным микропланшетам. Если определение производят в пробирках, объемы могут изменяться при условии неизменности соотношений компонентов в смесях.
Определение выполняют с использованием титрационного микропланшета, поддерживаемого при 370С. По 25 мкл каждого из разведений испытуемого раствора или раствора сравнения вносят в каждый из рядов ячеек. К содержимому каждой ячейки добавляют 125 мкл буфера для разведений, затем 25 мкл экарина и инкубируют в точности 2 минуты. К содержимому каждой ячейки добавляют 25 мкл хромогенного субстрата фактора IIa.
Регистрируют скорость изменения оптической плотности (2.2.25) при длине волны 405 нм непрерывно в течение 3 минут и получают среднюю скорость изменения оптической плотности (АА/мин). При невозможности непрерывной регистрации, оптическую плотность при 405 нм регистрируют с подходящими последовательными интервалами, например, продолжительностью 40 секунд, строят на миллиметровой бумаге график зависимости оптической плотности от времени и вычисляют из уклона полученной прямой значение АА/мин. Из значений АА/мин для каждого разведения испытуемого препарата и препарата сравнения вычисляют активность испытуемого препарата и проверяют достоверность определения с использованием обычных статистических методов (5.3).
2.7.19. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ Х
Количественное определение фактора свертывания крови Х производят по его специфической активации с образованием фактора Ха. Фактор Ха оценивают на основании его активности по расщеплению специфического хромогенного пептидного субстрата с такой же активностью Международного Стандарта или препарата сравнения, калиброванного в Международных Единицах.
За Международную Единицу принимают активность фактора Х в установленном количестве Международного Стандарта, состоящего из высушенного из замороженного состояния концентрата человеческого фактора свертывания крови Х. Эквивалентность Международного Стандарта в Международных Единицах устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.
Хромогенный метод количественного определения включает две последовательные стадии: индуцируемая змеиным ядом активация фактора Х и ферментативное расщепление хромогенного субстрата фактором Ха с образованием хромофора, который определяют спектрофотометрически. В соответствующих условиях испытания существует линейная зависимость между активностью фактора Ха и расщеплением хромогенного субстрата.
РЕАГЕНТЫ
Специфический активатор фактора X из яда цепочной гадюки (RVV). Белок, полученный из яда цепочной гадюки (Vipera russelli), который специфически активирует фактор Х. Восстанавливают в соответствии с инструкциями производителя. Восстановленный препарат хранят при 40С и используют в течение 1 месяца.
